一、引言

NK細胞（自然殺傷細胞）作為免疫系統中重要的細胞類型，因其強大的殺傷活性在免疫治療領域展現出巨大潛力。為了滿足大規模應用的需求，采用發酵罐進行NK細胞的培養是一種高效、可控的方法。本方案將詳細介紹NK細胞在發酵罐中的培養流程，包括準備階段、細胞復蘇與接種、培養條件設置、發酵過程監控、營養補給與換液、細胞收獲與凍存以及質量控制與評估等關鍵環節。

二、準備階段

1.  設備清洗與消毒：確保發酵罐及其附件（如攪拌器、通氣管道、溫度控制單元等）徹底清洗干凈，并進行無菌消毒處理，防止交叉污染。

2.  培養基準備：根據NK細胞的生長需求，配制適量的培養基，并加入必要的細胞因子（如IL-2、IL-15）和營養補充劑。培養基需通過無菌過濾后使用。

3.  發酵罐檢查：檢查發酵罐的密封性、攪拌效果、通氣速率及溫度控制系統是否正常工作。

三、細胞復蘇與接種

1.   細胞復蘇：從液氮罐中取出凍存的NK細胞，迅速置于37°C水浴中解凍，并加入預熱的培養基中稀釋，離心去除DMSO后重懸。

2.   細胞計數與活力檢測：使用顯微鏡或流式細胞儀進行細胞計數和活力評估，確保接種時細胞數量和活力符合要求。

3.   接種：將處理好的NK細胞接種至發酵罐中，初始接種密度根據實驗設計確定，通常控制在一定范圍內以保證最佳生長。

四、培養條件設置

1.  溫度控制：設置發酵罐溫度為37°C，模擬人體體溫環境。

2.  氣體環境：控制發酵罐內CO?濃度為5%左右，通入無菌空氣或氮氣混合氣體，保持適當的氧氣濃度。

3. 攪拌與通氣：根據細胞生長需求調整攪拌速度和通氣速率，確保氧氣和營養物質的均勻分布及代謝廢物的有效排除。

五、發酵過程監控

1. 細胞生長監測：定期取樣進行細胞計數和活力檢測，繪制生長曲線。

2. pH與溶解氧監測：實時監控發酵罐內pH值和溶解氧濃度，及時調整培養條件。

3. 代謝產物分析：定期分析培養液中的代謝產物（如乳酸、氨等），評估細胞代謝狀態。

六、營養補給與換液

1. 營養補給：根據細胞生長情況和代謝需求，適時向發酵罐中添加營養補充劑或調整培養基配方。

2.  換液：當培養液中代謝產物積累到一定程度時，進行部分或全部換液操作，以維持良好的生長環境。

七、細胞收獲與凍存

1.  細胞收獲：在細胞達到預定數量或生長狀態后，停止攪拌和通氣，將細胞懸液從發酵罐中取出。

2.   離心與洗滌：通過離心去除培養液和代謝廢物，用無菌PBS洗滌細胞后重懸。

3.  凍存：將處理好的NK細胞懸液與凍存液（如含10%DMSO的FBS）按一定比例混合后，分裝至凍存管中，進行梯度降溫后存入液氮罐中長期保存。

八、質量控制與評估

1.  無菌檢測：在發酵過程中及收獲前后進行微生物檢測，確保無細菌、真菌等污染。

2.  細胞質量檢測：對收獲的NK細胞進行數量、純度、活力及功能評估，確保符合應用標準。

3. 記錄與分析：詳細記錄發酵過程中的各項參數和數據，進行統計分析和總結評估，為后續實驗提供參考依據。

通過以上方案的實施，可以高效地實現NK細胞在發酵罐中的大規模培養，為臨床治療和科學研究提供高質量的細胞資源。